作者：毛俊峰，刘双珍，秦文娟，黄瑞尧，李凤云，吴小影 作者单位：中南大学湘雅医院 眼科，湖南 长沙 410008
【摘要】 目的 研究豚鼠近视眼视网膜Müller细胞原代培养的方法。方法 用半透明眼罩遮盖法建立豚鼠的近视眼模型。采用酶消化法培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞，用倒置相差显微镜观察Müller细胞的生长状况，以GFAP、Vimentin免疫组化染色进行细胞鉴定。结果 半透明眼罩遮盖豚鼠右眼2周后，遮盖眼眼轴延长，近视形成。原代培养的视网膜Müller细胞贴壁生长，胞体较大、扁平，GFAP、Vimentin免疫组化染色呈阳性。结论 酶消化法是培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的一种有效方法。
【关键词】 视网膜;Müller细胞;近视眼;豚鼠
Müller细胞是视网膜最主要的神经胶质细胞，与视网膜三级神经元共同构成“神经元-神经胶质”调控网络，参与视网膜的生理、病理过程。研究发现，Müller细胞能合成一些与近视眼发生密切相关的视网膜因子，如碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)[1]、多巴胺(dopamine， DA)[2]、视黄酸(retinoic acid，RA)[3]、转化生长因子β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)[4]，但是，目前尚不明确Müller细胞在近视眼形成中的具体作用及机制。豚鼠是目前国内研究近视眼的常用实验动物[5-7]，因此，我们建立豚鼠形觉剥夺性近视眼模型，探索其视网膜Müller细胞的培养方法及生长特性，为下一步研究Müller细胞与近视眼的关系打下基础。
1 材料与方法
1.1 豚鼠近视眼模型制作 3～4周龄的断乳三色豚鼠24只(清洁级，中南大学动物部提供)，体重200～220 g，雌雄不限。随机取其中12只，以0.3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，用自制半透明眼罩(材料为乳白色乳胶手套)遮盖右眼，缝4针固定于眼眶周围组织，以对侧未遮盖眼作自身对照。以剩余12只豚鼠的右眼作正常对照。遮盖2周后，去除眼罩，用0.5%托吡卡胺扩瞳验光测眼球屈光度，以A型超声测量眼轴长度，测3次，取平均值。
1.2 豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的培养 近视眼豚鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后，用75%酒精浸泡消毒5 min。在超净工作台内摘除豚鼠眼球，清除眼球外筋膜组织，用D-Hanks液漂洗3次。沿角膜缘后1 mm剪开眼球壁，去除眼前段，分离出神经视网膜，洗净附着的色素上皮。将其移入完全培养液(100 ml完全培养液由DMEM 80 ml、20%胎牛血清20 ml、青霉素100 μg/ml、链霉素100 μg/ml组成)中，用眼科显微剪刀把神经视网膜剪成小碎片，以0.25%胰蛋白酶消化10 min，用吸管吹打，制成细胞悬液。每1只眼球的视网膜接种于1个50 ml(25 cm2)培养瓶内，置于37℃、5% CO2的自动培养箱内培养，24 h后首次换液，去除悬浮细胞，以后每3～4 d换液1次，待细胞汇合成片、贴壁细胞达80%以上时按1：2传代。每天用倒置相差显微镜观察Müller细胞的生长状况。
1.3 豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的免疫组化染色 在6孔板中预先放入盖玻片，取第2代细胞接种其上，待细胞基本融合时取出，用D-Hanks液清洗，用4%多聚甲醛固定30 min后用于免疫组化染色。主要步骤如下：①3%过氧化氢孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性。②5%正常山羊血清封闭室温下作用10 min。③一抗GFAP多抗(Santa Cruz公司，浓度1：100)、Vimentin多抗(Santa Cruz公司，浓度1：100)于4℃过夜。④生物素标记二抗工作液于37℃孵育30 min。⑤辣根酶标记链霉卵白素工作液于37℃孵育30 min。⑥以DAB显色，苏木素复染，在显微镜下观察。以PBS代替一抗作阴性对照。
1.4 统计学方法 采用SPSS10.0统计学软件进行数据处理，对遮盖眼与对照眼的屈光度、眼轴长度进行t检验。
2 结果
2.1 豚鼠近视眼模型 遮盖2周后，豚鼠遮盖眼眼轴延长，近视形成。其屈光度为(-2.08±0.20)D，与自身对照眼(+1.67±0.15)D、正常对照眼(+1.55±0.20)D比较，差异有统计学意义(t=52.08、44.27，P<0.05);遮盖眼眼轴长度为(8.42±0.16)mm，与自身对照眼(8.06±0.13)mm、正常对照眼(8.10±0.11)mm比较，差异有统计学意义(t=6.05、5.71，P<0.05)。
2.2 豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的生长特性 原代培养接种24 h后，部分视网膜细胞贴壁，部分细胞呈椭圆形，有的堆积成团。首次换液去除大部分混杂细胞(如神经节细胞、光感受器细胞、双极细胞等)，贴壁的Müller细胞分裂旺盛，长出小突起，伸展，胞体饱满。10 d后，Müller细胞形态基本稳定，胞体较大、扁平，呈三角形、多角形或梭形等，折光性暗，胞核多为椭圆形，位于胞体中央或略偏位(见图1)。一般30～35 d后Müller细胞融合成片，相互交错或平行排列，进行传代。传代细胞多在15～20 d基本融合。第3代Müller细胞形态基本不变，生长速度减慢，细胞开始老化。第4代细胞基本停止生长，死亡速度明显加快。
2.3 豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的免疫组化染色 90%以上的培养细胞阳性表达GFAP(见图2)和Vimentin(见图3)，这些细胞的胞浆内有大量棕黄色颗粒，在胞核附近颗粒密度较高。以PBS代替一抗作阴性对照者(见图4)，细胞内无GFAP和Vimentin免疫反应着色。
3 讨论
近视眼发病机制的研究是目前眼科领域的研究热点之一，目前已公认近视眼的发生是在视网膜调控下巩膜主动重塑的结果[8-9]。目前，研究较多的参与近视眼调控的视网膜因子有RA、DA、血管活性肠肽、bFGF、TGF-β2等[9]。Müller细胞及其突起广泛分布于视网膜各类神经元胞体及神经纤维之间，与神经元相互作用，在视网膜的功能活动中发挥重要作用。Müller细胞感受视网膜神经元信号，调节神经元活性，与其能合成、分泌多种神经活性物质及表达多种信号因子的受体有关。体外研究表明，视网膜Müller细胞能合成DA、RA、bFGF、TGF-β2和表达bFGF的受体FGFR-1、DA受体、RA受体[1-4]。但Müller细胞是否能通过调控这些视网膜因子的表达，参与近视眼发生尚有待证实。因此，探索豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的培养条件具有重要意义。目前，视网膜Müller细胞的培养方法主要有组织块法和酶消化法两种。我们采用酶消化法成功地培养出豚鼠近视眼视网膜Müller细胞，并用GFAP、Vimentin免疫组化染色加以证实。本研究中，近视眼豚鼠的平均年龄是5～6周龄，其视网膜Müller细胞生长速度较慢，第1代细胞需30～35 d才能基本融合，传代细胞融合也需15～20 d。与近视眼豚鼠相比，成年人、大鼠和小鼠视网膜Müller细胞的培养周期相对较短，第1代细胞一般需2～4周就能融合[10-11]。另外，豚鼠近视眼视网膜Müller细胞衰老较快，第3代细胞生长速度明显减慢。因此，进行GFAP、Vimentin免疫组化染色时，我们选用第2代细胞。鉴于豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的生长特点，要想快速获得大量目的细胞用于科学研究有一定难度，因此，有必要继续改进其培养方法，譬如加入饲养细胞[12]、使用条件化培养基[11]等，进一步加快Müller细胞的培养速度，这都有待进一步研究证实。
视网膜细胞成分比较复杂，包含三级神经元、神经胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、血管内皮细胞、周细胞等，因此，Müller细胞的原代培养离不开细胞的纯化。豚鼠视网膜无血管，避免了血管内皮细胞和周细胞的混入，取材时仔细分离神经视网膜并反复清洗，尽可能减少掺入视网膜色素上皮细胞。视网膜神经元无分裂增殖能力，且不能贴壁生长，只能附着于Müller细胞表面，换液、传代后即可消失。通过GFAP、Vimentin免疫组化染色可知，我们获得的豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的纯度在90%以上。
综上所述，我们采用酶消化法成功培养出豚鼠近视眼Müller细胞，有助于为以后研究视网膜Müller细胞与近视眼的关系提供目的细胞。
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