【摘要】 目的 探讨p14ARF、mdm2、p53蛋白在鼻咽癌中的表达及其意义。方法 应用免疫组化法检测58例鼻咽癌组织和20例慢性鼻咽炎症组织中p14ARF、mdm2、p53蛋白的表达情况。结果 p14ARF、mdm2、p53蛋白在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎症组织中的阳性表达率分别为31.0%、41.4%、65.5%和100%、0、0，各个蛋白在两组之间表达的差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 p14ARF蛋白低表达以及mdm2、p53蛋白高表达与鼻咽癌有关。
【关键词】 鼻咽癌；p14ARF；mdm2；p53
Abstract: Objective To investigate the role of p14ARF，mdm2，p53 protein in the process of carcinogenesis of nasopharyngeal carcinoma. Methods Expression of p14ARF，mdm2 and p53 protein were detected by immunohisto- chemical methods in 78 formalin-fixed and paraffin-embedded tissues, including nasopharyngeal carcinoma (n=58), chronic nasopharyngitis (n=20).Results positive rates of p14ARF，mdm2，p53 in patients with nasopharyngeal carcinoma and chronic nasopharyngitis were 31.0%、41.4%、65.5% and 100%，0，0，respectively. Expression of p14ARF protein were significantly decreased and mdm2，p53 protein were significantly elevated in nasopharyngeal carcinoma compared with chronic nasopharyngitis (P＜0.05). Conclusion The results suggested that p14ARF-mdm2-p53 cell cycle regulation pathway may play important roles in carcinogenesis of nasopharyngeal carcinoma and may be valuable markers in nasopharyngeal carcinoma diagnosis and therapy.
Key words: nasopharyngeal carcinoma；p14ARF；mdm2；p53
细胞周期的调控是由许多不同基因组成的多条通路来完成的。在人类肿瘤细胞中，最主要的细胞周期调控通路有两条：RB通路(p16INK4a-CDK4/6-pRb- E2F)和p53通路(p14ARF-mdm2-p53)，近年来p14ARF- mdm2-p53通路的作用日益受到重视。本文应用免疫组化技术对鼻咽癌中p14ARF、mdm2、p53蛋白的表达进行检测并分析各个蛋白表达与鼻咽癌之间的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
研究材料取自2000-2005年我院鼻咽活检标本，共78例，其中鼻咽癌标本58例(低分化鳞癌57例，未分化癌1例)，鼻咽黏膜慢性炎标本20例；男45例，女13例；年龄12～79岁，平均49岁。所有病例诊断前未接受过抗癌治疗。以上标本均经10％福尔马林固定，石蜡包埋，4μm切片。
兔抗人p14ARF多克隆抗体购自美国Neomarkers公司，稀释度为1∶250；鼠抗人mdm2单克隆抗体、鼠抗人p53单克隆抗体、即用型第二代免疫组化Elivisi onTM广谱试剂盒、DAB显色剂、多聚赖氨酸以及其他免疫组化辅助试剂均购自福州迈新生物技术有限公司。1.2 方法
免疫组织化学染色，按照说明书进行。阴性对照以PBS代替一抗，阳性对照为已知阳性对照片。免疫组化结果判定标准参考许良中［1］等的方法，在光学显微镜下每张切片随机选取5个高倍视野记数细胞(鼻咽癌组织为癌细胞；慢性鼻咽炎症组织为上皮细胞)。根据阳性细胞染色强度和阳性细胞占所观察细胞数的百分比即阳性细胞百分比：染色强度打分：无色(0分)，淡黄色(1分)，棕黄色(2分)，棕褐色(3分)；阳性细胞所占百分比打分：无阳性细胞(0分)，阳性细胞数≤10%(1分)，11%～50%(2分)，51%～75%(3分)，＞75%(4分)；染色强度得分×阳性细胞百分比得分得出最终结果：0～3分为阴性(-)，＞3分为阳性(+)。
1.3 统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件进行统计学处理，率间比较采用χ2检验，相关性比较采用Spearman等级相关检验，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 p14ARF蛋白表达
p14ARF以细胞核出现着色为阳性(图1、2，见封2)。p14ARF蛋白在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎症组织中的阳性表达率分别为31.0%、100%，差别有统计学意义(P＜0.05)，见表1。
2.2 mdm2蛋白表达
mdm2以细胞核出现着色为阳性，其中部分细胞浆也有着色(图3，见封2)。mdm2蛋白在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎症组织中的阳性表达率分别为41.4%、0，差别有统计学意义(P＜0.05)，见表1。
2.3 p53蛋白表达
p53以细胞核出现着色为阳性(图4，见封2)。p53蛋白在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎症组织中的阳性表达率分别为65.5%、0，差别有统计学意义(P＜0.05)，见表1。表1 鼻咽癌和慢性鼻咽炎症中p14ARF、mdm2、p53蛋白的表达情况（略）
2.4 各蛋白表达相关性分析
Spearman相关分析表明，鼻咽癌组织中p14ARF、mdm2、p53表达均无相关性(P＞0.05)，见表2。表2 p14ARF与mdm2、p53蛋白表达的相关性（略）3 讨论
p53基因是研究最多最活跃的抑癌基因之一，至少50%以上的人类肿瘤存在p53基因高频率突变失活。从对原发性鼻咽癌标本的研究来看，鼻咽癌中p53基因的突变情况不同于其他肿瘤。大部分报道指出鼻咽癌存在野生型p53而很少突变［2］。但大量的研究显示：鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞株有p53蛋白过表达或称为聚集。本研究显示鼻咽癌及慢性鼻咽炎症组织中p53蛋白阳性表达率分别为65.5%和0，与文献报道基本一致［3-4］。
小鼠双微粒体mdm2(mouse double minute 2)基因最初是从鼠自发转化3T3成纤维细胞双微染色体基因扩增的筛选中发现的，是一种进化上保守的癌基因。正常情况下，p53诱导mdm2 基因转录，mdm2蛋白和p53 结合使其失活并促进p53 降解，形成了负反馈调节环路，因而在正常细胞中野生型p53 蛋白和mdm2 互相调节保持精细的平衡并处于低水平。mdm2在鼻咽癌中的作用目前研究资料较少，有文献报道mdm2在鼻咽癌组织中的主要活化方式是过表达而不是扩增［5］。
本研究结果显示mdm2蛋白在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎症组织中的阳性表达率分别为41.4%和0，差别有统计学意义，与廖芝玲等［6］等的研究结果基本一致。此外，本研究结果显示mdm2、p53蛋白在鼻咽癌组织中的阳性表达率分别为41.4%、65.5%，其中mdm2阳性的病例中p53的阳性率为75%。
鼻咽癌细胞中高表达的mdm2蛋白可能有类似于某些病毒蛋白产物的作用，它与野生型p53蛋白结合后，可使其半衰期延长，因而免疫组化容易检测到。而高表达的野生型p53蛋白又可调节mdm2蛋白的表达使其表达水平进一步提高，因而出现这两个基因在表达水平之间的高度相关性。这种高度相关性可以解释某些鼻咽癌组织中为何只出现p53蛋白的高表达而没有p53基因突变这一现象，同时也提示，mdm2可能通过野生型p53蛋白在鼻咽癌的发生发展过程中发挥着重要作用。
p14ARF是由p16INK4a的可变读码框架ARF(alternative reading frame)编码，它与INK4a共享Exon2和Exon3，取代Exonl α的是位于其上游约20kb的Exonl β，三个外显子共同编码的p14ARF蛋白是一种核蛋白，位于核仁和(或)核内包涵体中［7］，该蛋白相对十分稳定，半衰期接近6h，主要经过蛋白酶体途径降解。
p14ARF作为抑癌基因，其功能失活的机制主要包括基因的突变、缺失和甲基化。p14ARF的功能失活则导致肿瘤的发生，大量研究表明肺癌、胃癌、结肠癌、神经胶质瘤、白血病、胰腺癌、黑色素瘤、喉癌等中均有p14ARF的表达缺失。但国内外文献报道p14ARF高表达于几乎所有宫颈癌中。究其原因，可能与宫颈癌中高危型HPV E6、E7癌蛋白有关。
Kwong等［8］应用甲基化特异性PCR对4个鼻咽癌细胞株、4个异种移植瘤、33例鼻咽癌组织和6例正常鼻咽组织的研究发现p14ARF的启动子甲基化率分别为25%、25%、18%和0。李永强［9］等报道p14ARF蛋白在36例晚期鼻咽鳞癌中阳性表达率为44.4%。本研究显示该蛋白在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎症组织中的阳性表达率分别为31.0%、100%，差别有统计学意义。
另外，本研究采用Spearman相关分析未发现p14ARF、mdm2、p53表达有相关性。肿瘤形成是一个非常复杂的过程，而非单纯的线性关系，有必要进一步的研究。
【参考文献】
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［6］廖芝玲，何伟民，张斌，等.ΔNp63、p21WAF1及MDM2基因蛋白在鼻咽癌组织表达的研究［J］.广西医学，2003，25(11)：2101-2106.
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［8］Kwong J，Lo KW，To KF，et al.Promoter hypermethylation of multiple genes in nasopharyngeal carcinoma［J］. Clin Cancer Res，2002，8：131–137.
［9］李永强，胡晓桦，谢伟敏，等.p14ARF 、p53蛋白表达与H101治疗鼻咽癌疗效的关系［J］.肿瘤，2007，27(5)：390-392.